راهنمای طراحی پرایمر PCR
PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز)
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به عنوان یکی از مهم‌ترین اختراعات قرن بیستم در زیست‌شناسی مولکولی شناخته می‌شود. اکنون می‌توان مقدار کمی از ماده ژنتیکی را تکثیر کرد تا بتوان DNA را شناسایی و دستکاری کرد، عوامل عفونی مانند ویروس‌هایی که باعث ایدز، هپاتیت، سل می‌شوند را تشخیص داد، و همچنین تغییرات ژنتیکی از جمله جهش‌ها در ژن‌های انسانی و بسیاری وظایف دیگر را شناسایی کرد.
PCR شامل سه مرحله زیر است:
دناتوراسیون، اتصال و گسترش. ابتدا، ماده ژنتیکی دناتوره شده و مولکول‌های DNA دو رشته‌ای به رشته‌های تک‌تک تبدیل می‌شوند. سپس پرایمرها به نواحی مکمل مولکول‌های تک رشته‌ای متصل می‌شوند. در مرحله سوم، آنها توسط فعالیت پلیمراز DNA گسترش می‌یابند. همه این مراحل حساس به دما هستند و دماهای رایج برای این مراحل به ترتیب ۹۴ درجه سانتیگراد، ۶۰ درجه سانتیگراد و ۷۰ درجه سانتیگراد است. طراحی خوب پرایمر برای واکنش‌های موفق ضروری است. ملاحظات مهم طراحی که در زیر توصیف شده‌اند، کلید تکثیر خاص با بازده بالا هستند. مقادیر ترجیحی ذکر شده به‌طور پیش‌فرض در تمام محصولات ما وجود دارند.
طراحی پرایمر برای ریل تایم
1. **طول پرایمر**:
به طور کلی پذیرفته شده که طول بهینه پرایمرهای PCR بین 18 تا 22 نوکلئوتید است. این طول به اندازه‌ای کافی برای اختصاصیت مناسب و به اندازه کافی کوتاه است که پرایمرها به راحتی در دمای اتصال به قالب متصل شوند.
2. **دمای ذوب پرایمر**:
دمای ذوب پرایمر (Tm) به عنوان دمایی تعریف می‌شود که در آن نیمی از دو رشته DNA جدا می‌شوند و تک رشته‌ای می‌گردند و نشان دهنده پایداری دو رشته‌ای است. پرایمرهایی با دمای ذوب در محدوده ۵۲-۵۸ درجه سانتیگراد به‌طور کلی بهترین نتایج را به همراه دارند. پرایمرهایی با دمای ذوب بالای ۶۵ درجه سانتیگراد تمایل به اتصال ثانویه دارند. محتوای GC توالی به خوبی نشان‌دهنده Tm پرایمر است. تمام محصولات ما آن را با استفاده از نظریه ترمودینامیکی همسایه نزدیک که به عنوان بهترین روش برای تخمین آن در نظر گرفته می‌شود، محاسبه می‌کنند.
**فرمول محاسبه دمای ذوب پرایمر**:
دمای ذوب Tm(K)={ΔH/ ΔS + R ln(C)}، یا دمای ذوب Tm(oC) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273.15
که در آن
ΔH (کیلوکالری بر مول) : ΔH تغییر در آنتالپی است که با افزودن مقادیر آنتالپی هر جفت نوکلئوتیدی نزدیک به هم به دست می‌آید.
ΔS (کیلوکالری بر مول) : ΔS تغییر در آنتروپی است.
ΔS (کیلوکالری بر مول): آنتروپی نشان‌دهنده میزان بی‌نظمی یک سیستم است. ΔS تغییر در آنتروپی است که از مجموع مقادیر آنتروپی دی‌نوکلئوتیدهای نزدیک به هم به دست می‌آید. یک اصلاح نمکی نیز به ΔS اضافه می‌شود، زیرا پارامترهای همسایه نزدیک از مطالعات ذوب DNA که در بافر ۱M Na+ انجام شده‌اند به دست آمده است و این شرایط پیش‌فرض برای همه محاسبات است.
ΔS (اصلاح نمکی): ΔS (1M NaCl) + 0.368 x N x ln([Na+])
که در آن:
- N تعداد جفت نوکلئوتیدی در پرایمر است (طول پرایمر -۱).
- [Na+] غلظت نمک بر حسب میلی‌مولار است.
محاسبه [Na+]: [Na+] = غلظت یون تک‌ظرفیتی + ۴ برابر غلظت Mg2+ آزاد.
- دمای اتصال پرایمر: دمای ذوب پرایمر نشان‌دهنده پایداری هیبرید DNA-DNA است و برای تعیین دمای اتصال مهم است. دمای اتصال خیلی بالا (Ta) منجر به اتصال ناکافی پرایمر-قالب شده و بازده کم محصول PCR را به همراه دارد. دمای خیلی پایین Ta ممکن است به تولید محصولات غیراختصاصی ناشی از جفت‌شدن‌های نادرست منجر شود. تحمل جفت‌های نادرست بیشترین تأثیر را بر اختصاصیت PCR دارد.
فرمول Ta: Ta = 0.3 x Tm (پرایمر) + 0.7 Tm (محصول) – 14.9
که در آن:
- Tm(پرایمر) دمای ذوب پرایمرها است.
- Tm(محصول) دمای ذوب محصول است.
محتوای GC: محتوای GC (تعداد G و C در پرایمر به عنوان درصدی از کل بازها) باید بین ۴۰-۶۰ درصد باشد. طراحی پرایمر برای ریل تایم
گیره GC: حضور بازهای G یا C در پنج باز آخر از انتهای ۳' پرایمر (گیره GC) به اتصال اختصاصی در انتهای ۳' کمک می‌کند زیرا پیوند بین بازهای G و C قوی‌تر است. بیش از ۳ باز G یا C در پنج باز آخر از انتهای ۳' باید اجتناب شود.
ساختارهای ثانویه پرایمر: حضور ساختارهای ثانویه پرایمر که از تعاملات بین‌مولکولی یا درون‌مولکولی ایجاد می‌شوند، می‌تواند منجر به تولید محصول ناکافی یا بدون محصول شود. این ساختارها بر اتصال پرایمر به قالب تأثیر منفی می‌گذارند و در نتیجه تکثیر را مختل می‌کنند.
سنجاق سری (Hairpins): این ساختار از تعاملات درون‌مولکولی در داخل پرایمر تشکیل می‌شود و باید اجتناب شود. به طور بهینه، یک سنجاق سری در انتهای ۳' با ΔG برابر با -۲ کیلوکالری بر مول و یک سنجاق سری داخلی با ΔG برابر با -۳ کیلوکالری بر مول به طور کلی قابل تحمل است. طراحی پرایمر برای ریل تایم
تعریف ΔG: انرژی آزاد گیبس (G) مقدار کار قابل استخراج از یک فرآیند در فشار ثابت است. ΔG معیاری برای خودجوشی واکنش است. پایداری سنجاق سری معمولاً با مقدار ΔG آن نشان داده می‌شود؛ مقدار منفی بیشتر برای ΔG نشان‌دهنده سنجاق‌های سری پایدار و نامطلوب است. حضور سنجاق سری در انتهای ۳' بیشترین تأثیر منفی را بر واکنش دارد. طراحی پرایمر برای ریل تایم
دایمرهای خودی (Self-Dimers): دایمر خودی پرایمر از تعاملات بین مولکولی بین دو پرایمر هم‌حس ایجاد می‌شود که در آن پرایمر با خودش هم‌خوانی دارد. معمولاً مقدار زیادی پرایمر در PCR استفاده می‌شود، بنابراین اگر پرایمرها دایمر خودی تشکیل دهند، به جای اتصال به DNA هدف، بازده محصول را کاهش می‌دهند. به طور بهینه، یک دایمر خودی در انتهای ۳' با ΔG برابر با -۵ کیلوکالری بر مو
ل و یک دایمر خودی داخلی با ΔG برابر با -۶ کیلوکالری بر مول به طور کلی قابل تحمل است. طراحی پرایمر برای ریل تایمدایمر متقاطع (Cross Dimers): دایمر متقاطع از تعاملات بین پرایمرهای حس و ضد حس تشکیل می‌شود که هم‌خوانی دارند. به طور بهینه، یک دایمر متقاطع در انتهای ۳' با ΔG برابر با -۵ کیلوکالری بر مول و یک دایمر متقاطع داخلی با ΔG برابر با -۶ کیلوکالری بر مول به طور کلی قابل تحمل است. طراحی پرایمر برای ریل تایم
برای خدمات مرتبط با طراحی پرایمر می توانید به نوترکیب آزماتشخیص مراجعه کنید.
